细胞给药实验操作步骤【适合悬浮生长的细胞】

通常，贴壁生长的细胞通过换液方式进行细胞给药。但，悬浮生长或者半悬浮生长的细胞，换液时细胞会大量丢失或者脱落。所以，不能采取换液方式给药。需采取先给药，再铺板（接种细胞）的方式进行细胞给药。具体操作步骤如下：

1、【制备细胞单悬液】确保细胞状态良好，无菌环境下收集细胞上清，并吹打成单悬液。若目的细胞为半贴壁半悬浮生长（例如：人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)，图1），则需要收集细胞上清（含有悬浮的细胞）。再取37度预热的PBS清洗1遍，使用“润湿消化法”消化细胞（可减少胰酶残留），用细胞上清终止消化。

2、【细胞计数】取样稀释，细胞计数，按照5K/Well/100ul for 96 Plate，使用完培制备细胞单悬液细胞。

3、【药物配置】用预热的完培，按照药物配置方案或者Plate Map（图2）配置工作浓度2倍的含药培养基（完培）。若为细胞毒性实验，可在完培内预先添加死亡细胞检测探针（绿色荧光，YOYO-1也成Ki-480死亡细胞探针），以便检测死亡细胞的数目。

4、【给药】无菌环境下，按照Plate Map（图2）将含药培养基，按照100ul/Well添加到各个给药条件对应的孔中。

5、【铺板细胞】无菌环境，按照Plate Map（图2）将含药培养基，按照100ul/Well添加到各个给药条件对应的孔中。此时，培养总体积为200ul/Well for 96 Plate，各个给药组的含药完培被稀释了一倍，便与Plate Map的给药工作浓度一致。

6、【细胞增殖和毒性0h检测】细胞接种后，无菌环境下，水平放置3-5分钟。再将给药的96孔细胞培养板放置实时动态活细胞成像系统（InCucyte）内，明场（检测细胞增殖）和绿色荧光成像（检测死亡细胞计数），记作0h，作为后续研究增殖和细胞毒性的基础（细胞数目或细胞比例或细胞汇合度或细胞面积；死亡细胞数目）。

6、【细胞增殖和毒性连续检测】给药12h、24h、48h和72h，按照6操作，分别成像一次。也可设置1h或者2h检测一次。

7、给药培养和成像检测72h后，进行数据分析和数据、照片导出。