细胞抗体内化实验操作步骤

抗体内化检测原理：Incucyte® Fabfluor-pH 抗体标记染料设计为偶联pH 敏感荧光团的Fab 片段，用于快速、简便地标记含Fc 的测试抗体。基于pH 敏感染料的系统利用溶酶体的酸性环境来量化被标记抗体的内化。Fabfluor 标记的抗体位于中性细胞外溶液（pH7.4）中，它们与细胞表面特异性抗原相互作用并被内化。一旦进入溶酶体，它们就会进入酸性环境（pH 值4.5–5.5），并观察到荧光显著增加。在没有特异性抗原表达的情况下，不会发生内化，标抗体的荧光强度很低。与Incucyte® 分析软件联合使用，将荧光信号进行量化，使得背景信号最小化。这些试剂已被验证可用于多种细胞类型的多种不同抗体。Incucyte® 活细胞分析系统可对抗体内化进行实时动态评估【来源于Incucyte® Fabfluor-pH 抗体标记染料说明书】。抗体内化实验操作步骤：1、【材料准备】37度预热的完培和PBS，常温恢复的胰酶，抗体内化探针母液（Incucyte® Fabfluor-pH Antibody，Cat#4722）4度避光解冻和96孔板细胞培养板等。

2、【细胞消化】细胞状态良好（汇合度达到75%+，无污染，培养基未明显变黄，无明显漂浮物或碎片），收集细胞上清。再取37度预热的PBS清洗1-2遍，使用“润湿消化法”消化细胞（可减少胰酶残留），用细胞上清终止消化，减少离心对细胞活力的影响。

3、【细胞计数】分别细胞单悬液母液多倍稀释，细胞计数。

4、【配置细胞单悬液】抱团生长的细胞或悬浮生长的细胞，按照30K/Well/100ul for 96 Plate（最多不超过50K/Well，密度太高或太低，影响内化），使用完培配置细胞单悬液；铺路石方式生长的贴壁细胞，按照10K/Well/100ul for 96 Plate（最多不超过20K/Well，密度太高或太低，影响内化），使用完培配置细胞单悬液。若为悬浮生长的细胞，最好预先使用0.01% 多聚赖氨酸(Sigma Cat. No. P4957，或索莱宝)或Fibronectin (Sigma Cat. No. A7906)包被96孔板内底部，再接种细胞。5、【细胞铺板或接种】准备电子分液器，调节分液体积为100ul，每次分液10次。充分重悬后铺板或接种。点击此观看具体操作视频。优先使用黑底的细胞培养板进行内化实验，做好避光操作，透明的常规细胞培养板也无明显影响。

6、【细胞成像质控】细胞铺板，无菌环境静止水平放置5-10分钟后，再将整板水平放入InCucyte，明场和红色荧光20X或10X成像，每孔成像4个视野，作为细胞接种计数质控的基数。

7、【抗体内化给药前质控】细胞整板水平放入CO2培养箱，贴壁过夜后，再将整板水平放入InCucyte，明场和红色荧光20X或10X成像，每孔成像4个视野，作为细胞给药前的基数。细胞汇合度大于75%，小于95%，为宜。

8、【抗体内化给药配置】使用预热的完培，按照“抗体内化探针（Fabfluor-pH）与抗体的物质量浓度比为3：1”的原则，避光配置给药工作液。贴壁生长的细胞或悬浮生长的细胞工作体积均为100ul/Well/for 96 Plate。也可依据细胞代谢特性，适当减少体积，但不低于60ul/Well。悬浮生长的细胞需补液方式给药，宗体积会增大一倍。所以针对悬浮细胞，配置工作液时，浓度需增加一倍。设置抗体内化探针（Fabfluor-pH）对照组（不添加抗体）和正常对照组（不添加探针，也不添加抗体）。请注意：a、贴壁生长的细胞以换液方式给药，悬浮生长的细胞以补液方式给药。所以，前者抗体和内化探针均按照正常的浓度配置（3:1），后者抗体和内化探针均按照正常浓度的2倍配置（6:2）。b、由于抗体内化探针（Fabfluor-pH）分子量（50Kd）为lgG抗体分子量（150Kd）的1/3的，所以，内化实验工作体系中，抗体内化探针（Fabfluor-pH）与抗体的物质量浓度比为3：1。即，探针的物质量浓度为抗体工作浓度的3倍。通常工作体系中抗体内化探针（Fabfluor-pH）为50nM-150nM为佳，具体需依据抗体、细胞的特性，进行预实验测试。9、【抗体内化孵育】将配置好的含抗体内化探针（Fabfluor-pH）的各个给药组完培（已验证，血清不会影响抗体内化探针的荧光表达），放置CO2培养箱，37度孵育30分钟（避光）。10、【抗体内化换液给药】贴壁生长的细胞，以小枪头套大枪头（见图2），吸走培养基，换液上述9种孵育过含探针和抗体的完培，100ul/Well。悬浮生长的细胞，补液100ul/Well。

11、【给药0h成像内化检测】给药完，将细胞整板放入InCucyte，明场和红色荧光20X或10X成像，每孔成像4个视野，作为细胞给药0h的基数。

12、【抗体内化连续成像检测】将细胞整板放入镶嵌在CO2培养箱里的InCucyte，明场和红色荧光20X或10X成像，每孔成像4个视野，设置每2h或6h或12h或24h成像一次，成像48h。通常在给药2-6h（图3，抗体内化2h成像），才开始表达红色荧光，36h达到最大，48h后开始减弱。

13、【抗体内化数据分析】使用InCucyte自带软件，进行明场和红色荧光分析，统计抗体内化的数目（红色荧光斑点）、面积或荧光强度，并导出数据和照片。

A、抗体内化面积变化曲线（图4）

B、不同抗体内化效果比较曲线（图5）：

C、细胞抗体内化时间间隔照片（图6）：